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Flow Cytometry | 細胞週期分析 2020/02/05

Flow Cytometry | 細胞週期分析

 

細胞週期主要分為五個期間:G0、G1、S、G2和M期。G0期通常是指細胞由靜止狀態開始進入G1之間的短暫時間,當細胞進入G1其後便會開始增生,是DNA含量最多的時期,為進入S期作準備;S期開始,細胞進行複製,二倍體含量增加,進入G2期後即完成有絲分裂的第一個步驟,細胞骨架消失、紡錘體出現,M期則是指細胞一分為二的過程。

流式細胞儀可以利用核染劑— propidium iodide (PI) 觀測DNA含量的變化,藉此偵測細胞週期變化。PI可標定核酸,無論是RNA或是DNA都會被標記,因此,使用PI染劑時需要搭配RNAase消除被PI標記到的RNA。PI 染劑可以透過 488 nm的雷射光激發,激發/發散光約為495/639 A。

 

 

 

細胞週期分析範例

透過流式細胞儀分析細胞週期結果呈現如下圖。橫軸為螢光強度,縱軸為細胞數量,最高峰(左邊往右邊數的第一個波鋒)代表細胞在G1,此時的染色體數量為2n;下一個明顯的波鋒則代表細胞在G2和M期,此二期的染色體數量皆為4n;介在這兩明顯波峰之間代表著S期,染色體正在複製,因此染色體數量從2n到4n都有。由於細胞週期中,大部分的細胞落在G1(為細胞週期四個階段中所站時間最長的時期),因此第一個波鋒的高度最高。

    

 

細胞週期分析常見的問題及解決辦法

 

問題

可能的原因

建議解決方法

流式細胞儀檢測訊號微弱。

樣品穿透不足。

70%冰乙醇穿透效果較好。

須全程保持4˚C,以確保穿透效率。

細胞分佈範圍不理想。

流式細胞儀設置不當。

利用對照組或是以前實驗的參數,在儀器上設置正確的參數。

樣品製備。

在加入70%冰乙醇時,應輕輕vortex,避免細胞結塊或破損。

流式細胞儀吸樣管阻塞。

以高流速,10%漂白水5-10分鐘、二次水5-10分鐘的順序清洗。

DNA含量的一維圖形無法解析細胞週期的不同階段。

碘化丙啶 / RNase (PI/RNase) 溶液染色不足。

直接將細胞懸浮於200μL/mL PI/30μg/mL RNase的溶液中,染色15-30分鐘並在2小時內上機完成。

細胞沒有分散均勻

上機前將細胞以40 μm的篩網過濾至上樣管中,確保細胞是單顆的狀態,以免干擾訊號表現。

細胞生長停滯

確保細胞在指數成長狀態下,細胞在培養時過少或過多都會影響細胞週期分析結果。

儀器流量設定不正確

過高的流速會導致過高的變異係數(CV),會導致細胞週期中不同階段的分辨率下降,一般會選擇中流速進行上樣。

 

  • 錯誤結果—G2/M期的DNA含量應該要是G0/G1期的1/2,穿透不完全可能會造成此結果。

 

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