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“ CRISPR 並非第一種基因編輯的方式,但是是迄今為止「最精確」基因編輯的技術 ”

 

      CRISPR為近年來發展的新興熱門技術,全名為群聚且有規律間隔的短回文重複序列」(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, CRISPR),其來自於細菌為抵禦病毒所發展出的免疫抵禦機制。目前已有3套CRISPR系統(I-III)被發現,TypeI、III   而最廣泛被使用作為基因編輯的為CRISPR Type II System,此套系統包含 nuclease Cas9, crRNA 以及tracrRNA,透過tracrRNA輔助crRNA到目標互補DNA序列上,Cas9進行雙股DNA斷裂(Double strand break, DSB),進而達成基因敲除 (Knock-out) 編輯功能。科學家更進一步的將crRNA array以及tracrRNA結合成單一股 single-guide RNA (sgRNA),使的CRISPR/Cas9系統更容易進行操作。

     

Figure : 20-nt sgRNA (藍色) 與scaffold (紅色) 引導 Cas9 nucleaes (黃色)到 genomic DNA 互補序列上,Cas9 nuclease 在5' NGG 序列 (PAM 粉紅色) 前方3個base pair進行專一性的DSB。 ref: nature protocols | VOL.8 NO.11 | 2013

 

    ACE Biolabs 具有台灣CRISPR 專業團隊,提供設計gRNA的專業意見,並有多種gRNA plasmid可供選擇,以及因應客戶細胞種類選擇運送方式 (ex Transfection、Lentivirus) ,以達到最高效率、最低off - target的機率。

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CRISPR 基因編輯 服務特點

1. 嶄新兩條gRNA進行DSB技術,提升目標準確率

2. 使用sgRNA+Cas9+Reporter 三合一質體,不需像傳統嘗試不同比例。

3. 種類全方面,各類型細胞皆可操作

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CRISPR 基因編輯 服務流程  CRISPR服務委託書

 

流程

項目

內容

接案

  • 了解客戶需求
  • 簽訂服務委託書
  • 預付40%訂金與材料費

 

材料準備

細胞培養條件確認

 

(約 3 至 5 週)

  1. 檢測細胞黴漿菌汙染
  2. 特異細胞株轉染條件確認。無參考資料,需測試轉染條件。

Sp-gRNA建構

 

(約 3 至 5 週)

  1. 確認基因編輯的區塊。
  2. 設計可以涵蓋該區塊的引子對,並確定PCR條件。
  3. 建構2到3個Sp-gRNA表現載體,DNA定序確認Sp-gRNA expression cassettes。(0.5 mg/vector)

轉染Cas9和Sp-gRNA表現載體到指定細胞株

轉染Cas9和Sp-gRNA表現載體到指定細胞株後,以抗生素篩選。

(約 2 至 3 週)

  1. 收集總體細胞之gDNA,以PCR方法判定是否產生gene editing。
  2. PCR products經TA cloning,做DNA序列分析。(Optional)

細胞株篩選

篩選標的基因兩個alleles均破壞的細胞株

  1. 收集細胞株之gDNA,以PCR方法判定判定兩個alleles均遭破壞。
  2. PCR products經TA cloning,做DNA序列分析。(Optional)

細胞株再篩選

上述細胞株再經一次篩選

收集細胞株之gDNA,以PCR方法判定兩個alleles均遭破壞。

DNA序列分析

PCR products經TA cloning,做DNA序列分析

以DNA序列分析方式確認兩個alleles均遭破壞。

細胞培養至出貨規格

CRISPR KO Cell Line (2x106 cell /tube)凍管一管

 

客戶使用檢測

請於一個月內測試細胞,並告知測試結果

 

 

 

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