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Gene Cloning | 如何將目標基因克隆到載體中 (下) 2019/05/03

Gene Cloning | 如何將目標基因克隆到載體中 (上)

  • 三、目標片段連接到「載體」上:分成純化目標片段和連接反應。
  1. 純化目標片段 DNA

經由瓊脂糖膠體電泳確認後,必須要從膠體中純化出目標片段 DNA。這部分實驗都是使用市面上販售的套組完成,而純化的方法是透過管柱的吸附。首先切下含有目標片段 DNA 的膠體,使用特殊溶劑,在55-65oC 作用下溶解凝固的膠體。透過管柱吸附住 DNA,使用緩衝液清洗管柱中的 DNA 以去掉雜質和鹽類,最後再沖下 DNA,基本上於一個小時之內完成。

 

  1. 連接反應:

純化後的 DNA 通常會先接到特殊「載體」上,方便其他實驗操作。通常使用的「載體」為質體,此為細菌天生的小型環形 DNA,主要功能是對抗環境壓力和毒素。這連接的反應即稱作連接反應 (ligation),而使用「質體」並不是環形,而是廠商做出來的線形質體,專門作為聚合酶連鎖反應後產物的連接反應。連接反應中的原件有 vector insertvector 為線形質體,經過酵素將環形處理成線形,包含質體所有的構造 (複製起始、抗生素、螢光等等);而 insert 為短片段的目標基因。除此之外,還需要連接酶 (ligase),以及反應所需要的鹽類溶液和提供能量的 dNTP (通常會直接附成一管緩衝液)。反應的溫度和時間按照廠商建議,通常是15-25oC 反應1-2小時,可以延長時間以增加效率,也有人建議4oC 反應過夜。

連接反應成功率決定因素是 vector insert 的比例,insert 的莫耳數要大於 vector,以增加碰撞機率。根據科學家們過去實驗的經驗,通常比例為一莫耳的 vector 配上3-5莫耳的 inert,提供 vector 的廠商會有建議比例。計算莫耳數會需要重量和分子量 [重量 (g) 除以分子量 (g/mol) 即為莫耳數],分子量可用長度乘以平均鹼基對的分子量 (700 g/mol) 估算,或是由 vector/insert 長度比例計算即可。也就是同樣重量的 vector/insert 莫耳數比為長度的倒數比。而重量的話由於一般常使用測定核酸濃度的 Nanodrop 經常會高估,所以建議由電泳結果確認。DNA marker 中不只提供不同長度的 DNA 片段,同時也註明了各個片段的濃度,因此經由比對聚合酶連鎖反應結果的目標片段,可以大致判斷出重量。最好的做法是從瓊脂糖膠體純化出 DNA 後,取少量再進行一次電泳,比對 DNA marker 來得知濃度。但是,由於目的在於連接反應的成功,而不需要最高效率,因此也可以純化效率6-8成來估算濃度。又或者可以一次嘗試多種比例,避免估算錯誤而導致連接反應失敗。

連接反應中選擇的 vector 和聚合酶的特性息息相關。DNA 片段的末端有分成黏滯端 (sticky/cohesive end) 和平滑端 (blunt end),前者表示末端的雙股並不等長,而有其中一股較長,後者則是雙股等長。某些聚合酶進行反應時,會在末端的3’加上一個 adenine 鹼基 (A),使得最終產物會在兩端的3’多一個鹼基,因此必須選擇在兩端5’帶有 thymine 鹼基 (T) vector (市面上稱作 TA vector)。黏滯端的連接反應效率通常比平滑端高許多,平滑端的連接反應需要較多的連接酶和延長反應時間,有些廠商會提供 PEG (polyethylene glycol) (最終濃度5%),用來提高效率。

  • 四、確認序列:放大含有目標片段的「載體」,以及送定序確認。

連接反應後的質體必須先放大處理,才有足夠的當量送定序。一般會使用細菌作為放大質體的宿主,因此 vector 包含細菌內的複製起始和抗生素篩選基因。將質體送進細菌的過程稱作「轉形 transform」,轉形其實是細菌天生的特殊機制。最早研究發現,將經過煮沸殺菌的含有抗藥性的細菌,和沒有抗藥性的細菌一起培養,則可以得到有抗藥性的細菌。後來發現抗藥性基因存在於質體上,並且細菌天生具有吞噬外來 DNA 的能力,因此可以獲得抗藥性。只不過這樣的能力很弱,不足以讓我們完成實驗。因此,後來發展出利用電流或是化學短暫且些微地破壞細胞膜,增加細胞膜的通透性,使質體更容易進入細菌。製作出來的細菌即稱作「勝任細胞 competent cell」,可以自己在實驗室製作,或是向廠商購買。

比較常用的是化學的方式,只需要冰塊和水浴槽即可操作。步驟可分成四步,冰上平衡、熱刺激 (heat shock)、冰上休息以及回復 (recovery)。冰上平衡為質體和勝任細胞的混合,前者溶液體積不得超過1/10,以免破壞勝任細胞周遭的化學環境,時間為5-10分鐘。再來是透過熱增加細胞膜通透性,通常是42oC 30-60秒,此步驟要精準測量時間,時間過長會破壞細菌,導致轉形失敗。冰上休息3-5分鐘可以穩定細菌的細胞膜。回復則是加入營養液 (LB SOB),讓細菌能夠修復一些損傷,以及表現抗生素抗性基因。回復條件為37oC 1-4小時,實際時間要看勝任細胞的能力以及抗生素機制,常用的有 ampicillin, kanamycin chloramphenicol,後兩者機制是抑制蛋白質合成,對於細菌的損傷較大,需要較長的回復時間;而 ampicillin 則是抑制細胞壁合成,對於細菌本身損傷很小,我們自己的實驗發現完全不需要回復。

轉形完成後要將菌液塗到瓊脂盤 (agar plate) 上,瓊脂盤需要事先製備,並加入質體使用的抗生素。塗盤完的瓊脂盤放到37oC 中培養過夜,預期會看到一顆顆菌落,理論上每顆菌落都是由一顆細菌長成,所以稱做單一菌落 (single colony)。單一菌落擁有的質體會全部相同,因此可用來做後續的定序分析。另外,為了分辨或去除出 vector 本身自己發生的連接反應,因此大部分的聚合酶連鎖反應用的線形質體都有經過特殊設計,在 insert 接進去的位置上放上特殊的酵素,若 inert 成功接入,則會破壞酵素活性。常見的有兩種,第一種是 beta-galactosidase,可以分解 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside),形成藍色沉澱。因此 inert 接入反應成功的菌落呈現白色,反之則為藍色,此方法被稱作「藍白篩」,可以分辨出成功和失敗的菌落。另一種則是放入致死基因,失敗的菌落就會死亡,只有成功的得以存活,因此最後出現的菌落皆攜帶成功的質體。

最後就是質體上目標基因的序列確認,可以直接送件菌落本身,或是少量質體抽取後送件。基本上都是交由外面廠商進行,需要注意的是要符合廠商要求的濃度和體積。由於是使用「Sanger 定序法」,此為終止的聚合酶連鎖反應,透過加入特殊的帶螢光鹼基,得到不同長度的片段,再透過電泳分離,以不同螢光確認鹼基,因此還必須加入一條引子做反應 (一管一條引子)。廠商通常會傳回兩個檔案,一個是文字檔,方便客戶直接拿來和目標基因的序列比對;另一個檔案為直接螢光結果,可以用來確認定序的可信度,通常可信度只有500-800 b.p.,因此長度較長的目標基因需要以不同引子定序送件,通過交叉比對才能完全確認。若定序結果顯示完全相同,則表示 cloning 順利完成,之後可能還會因為不同需求進行「subcloning」,將目標基因「移動」到其他質體上,此部分將會在其他文章中仔細說明。

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