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Recombinant Protein | His-tag 重組蛋白純化系統 2019/12/18

Recombinant Protein | His-tag 重組蛋白純化系統

 

His-tag 中文稱之為組氨酸標籤,His 可被鎳柱吸附,用於純化重組蛋白,無論表達的蛋白是可溶的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和層析(IMAC)純化,是由連續六個以上的組氨酸所組合而成的一段胺基酸序列。His-tag是蛋白質重組技術中經常用到的一種標籤,其序列為6個組氨酸HHHHHH,其特點是分子量小,只有不到0.84 KD,基本不改變蛋白質的生物結構,不改變蛋白質的溶解性,更重要的是它使蛋白質的純化變得極為方便。根據組氨酸上的咪唑環可以與二價金屬離子結合的原理,His-tag 可結合在目的蛋白的 C末端或 N末端,形成特殊的結構,以便於進行下一步的純化及檢測。可以利用金屬離子親和層析技術純化帶有 His標籤的蛋白,即將含有目的蛋白的裂解液通過固定的二價金屬離子(通常是二價 Ni 離子)填料,帶有 6*His-tag的蛋白質即與填料結合,其它蛋白不與填料結合,最後再用高濃度的咪唑即可將目的蛋白洗脫下來。

 

一、His-tag 融合蛋白的優勢

His-tag 為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一。His-tag 單株抗體可以用來鑑定His-tag的蛋白質的表達情況(如目的蛋白的相對表達量、分子量)、在細胞中的定位以及其它特性。His-tag 作為蛋白純化時的首選標籤,其優勢在於:

  1. C末端或 N末端的 His-tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容,有利於蛋白表達。
     
  2. 採用 IMAC(固定化金屬離子親合層析)純化His-tag融合蛋白操作更加簡便。
     
  3. His-tag 對目標蛋白本身特性幾乎沒有影響,不改變目標蛋白本身的可溶性和生物學功能。
     
  4. His-tag 非常小,一般不影響蛋白質的功能,且在融合蛋白結晶後對蛋白的結構沒有影響。
     
  5. His-tag 的免疫原性相對較低,可將純化的蛋白直接注射入動物體內進行免疫並製備抗體。
     
  6. His-tag 融合蛋白的純化適用範圍廣,可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化,也可以在變性條件下進行純化。前者通常用來純化疏水性強的目的蛋白,而後者則通常純化包涵體 (inclusion bodies) 蛋白。
     
  7. His-tag 可與其它親和標籤構建成雙親和標籤,並可應用於多種表達系統。

 

二、His-tag 融合蛋白的純化原理

His-tag可與多種金屬離子發生特殊的相互作用,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白質表面的特性,使之被吸附在凝膠柱上,從而達到分離純化蛋白的目的。組氨酸(His)的殘基上帶有1個咪唑基團,可以和Ni2+、Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結合在金屬離子上,這些金屬離子能夠用結合配體固定在層析介質上,因此帶有 His-tag 的蛋白在經過裝配了金屬離子的層析介質時可以選擇性的結合在介質上,而其他的雜質蛋白則不能結合或僅能微弱結合。結合在介質上的 His-tag 蛋白可以通過提高緩衝液中的咪唑 (Imidazole) 濃度進行競爭性洗脫,從而得到較高純度的 His-tag 蛋白。在親和純化實驗中的使用最為廣泛的是Ni2+。Ni 管柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有 His-tag 融合蛋白結合,組蛋白標籤一般是6個組氨酸( 鹼性氨基酸 ) 。在蛋白上樣後,帶有His-tag 的融合蛋白與Ni2+特異性結合,停留在管柱裡,其他雜蛋白流出。Ni 管柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與咪唑結合,利用咪唑梯度洗脫,咪唑結合到硫酸鎳上,His-tag 融合蛋白就被洗脫下來,收集流出液體可取得His-tag 融合蛋白,然後透析掉咪唑。

 

三、Ni2+親和層析柱的種類

根據結合基團的不同,Ni2+親和層析柱可分為兩類:一類是Ni-IDA,另一類是Ni-NTA。Ni2+有六個結合價位,其中 Ni-IDA 結合了三價,Ni-NTA 結合了四價。所以 IDA的載量要比 NTA 高。在同樣條件下,Ni-IDA 洗脫時所需的咪唑濃度也低於 Ni-NTA。Ni-IDA 較弱的結合力使金屬離子在洗脫階段時容易浸出,與目標蛋白緊密結合,從而導致分離蛋白產量偏低,產品不純以及金屬離子污染等問題。NTA 的顆粒粒度均勻,粒徑更小,並且結合鎳更穩定,能耐受較高的還原劑,使填料更加穩定,鎳離子不易脫落,因此選擇 Ni-NTA 親和層析柱進行蛋白純化。

NTA

IDA

四價,配位數為4

三價,配位數為3

較高的結合特異性

通常有較多的非特異性結合

通常較低的產量

較低的咪唑洗脫濃度

與金屬離子較強的配位作用

較高的金屬離子負載能力

較低的金屬離子漏出

較高的金屬離子漏出

 

IDA和NTA廣泛用於將過渡態金屬離子結合到基質上,該整體可作為親和樹脂。這兩種配體與金屬離子結合的價態數目不同(IDA是三價而NTA是四價;價態用橘色標出),這會影響純化到的蛋白的質量。

 

His-tag 融合蛋白純化相關產品

Cat. No. Product Name Size
C3036 Imidazole 25g
PX0002 Ni NTA Beads 6FF 25 ml

 

His-tag 融合蛋白相關抗體

Cat. No. Product Name Application Reactivity Host
A00001TC 6xHis Monoclonal Antibody WB, ELISA All Mouse
A00015TC His-Tag Monoclonal Antibody WB, IF, ELISA, IP All Mouse
A00031TC His-Tag Monoclonal Antibody WB, ELISA All Mouse
A00039TC His-Tag Monoclonal Antibody WB, ELISA All Mouse
A00041TC His-Tag Monoclonal Antibody WB, ELISA All Mouse

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