Flow Cytometry | 流式細胞技術的應用 2020/01/22

Flow Cytometry | 流式細胞技術的應用

流式細胞儀是現代生物學、生物醫學、腫瘤學、血液學、免疫學、藥理學與臨床研究等領域中,不可或缺的利器。最早的原型機是在1972年由史丹佛大學的幾位教授研製而成,1973年Becton Dickinson與其合作,以FACS商標名推出第一台流式細胞分選儀。

流式細胞儀上樣簡單、快速,可檢驗的方式多元,成為分生實驗中常用的檢驗方法。尤其是目前最流行的"幹細胞"研究,幹細胞研究最重要的就是要知道幹細胞分化後,是不是成為我們需要的細胞種類,這時候,流式細胞儀就是個篩選細胞的最佳利器,不僅可以定性也可以定量,某些機型的流式細胞儀甚至可以收集分選出細胞,提高細胞的純度。

 

原理簡述

流式細胞儀主要由流體學系統(fluidics)、光學與電子系統(optics and electronics)組成。待測樣本中的細胞經流體系統傳送,依序地通過雷射照射區域,細胞受雷射激發而產生訊號,訊號接收器接收到訊號後會放大訊號,將這些訊號輸入電腦分析處理,電腦再將資料處理後變成圖形顯示在螢幕上。

流式細胞儀產生並分析的信號主要有光散射信號和螢光信號,藉由光訊號的強弱和波長不同,可以得到細胞大小、型態與顆粒化等資訊。螢光訊號可提供不同細胞生物學特性並應用於許多實驗中。

 

流式細胞技術應用

生物學/生物醫學應用

  1. 細胞週期分析

    在細胞週期進行時,DNA含量會隨著細胞進入不同周期而有增減,利用螢光對細胞進行相對DNA含量測定,可以分析細胞各個週期的百分比。
     
  2. 細胞凋亡

    細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡,在細胞接收到血液或組織液中特定的訊號因子時,會觸發一連串連續性的細胞變化,最後導致細胞死亡,但這樣的細胞死亡行事不會影響周圍健康的細胞,是一種細胞自然的淘汰機制。

    細胞凋亡最常使用的是Annexin V-PE染色,可以快速分析早期細胞凋亡。細胞凋亡早期會有膜磷脂醯絲氨酸phosphatidylserine(PS)由細胞脂膜內側翻向外側的現象,Annexin V會結合到磷脂蛋白上的鈣離子,接上PE呈色,可被波長488 nm左右激發,另外以PI染色細胞核可以分辨早期凋亡與死細胞。

    細胞凋亡的檢測在抗癌藥物的研究中應用廣泛,通常配合細胞週期分析結果,作為判斷標的藥物抗癌效果的依據。
     
  3. 細胞型態

    前散射光(FSC)可以分析細胞大小、測散色光(SSC)可以分析細胞的顆粒性,利用此特性可以分別細胞是否健康;正在凋亡程序中的細胞FSC會變小,SSC是先增加後減少,利用此原理可以定性細胞
     
  4. 細胞內pH值測定

    螢光染料激發光譜或是發射光譜是會隨pH值而不同的,在生理的pH值內,螢光比例與pH值擁有很好的線性關係,因此,可以用螢光的比例推算pH值。
     
  5. 細胞內鈣離子濃度測定

    利用特殊螢光染料(Furd-Red、Fluo-3、Rhod-2等)通過乙醯甲脂(AE)導入細胞後會與鈣離子有特異性結合,螢光的激活或發射性與鈣離子濃度有關,可利用比例法或是直接檢測螢光而得到鈣離子濃度。

 

腫瘤學應用

腫瘤學研究是流式細胞技術在臨床醫學中最早的應用。人體中正常組織要明確變質並確診癌症需要很長的時間,而流式細胞儀可以偵測出癌前細胞"量"的增多,進而發現癌前病變的部位,簡單來說,正常人體細胞有穩定的DNA二倍體量,通常癌變的細胞會不正常增生(已有文獻證實),而流式細胞技術可以精確得檢測出DNA含量變化,是癌前病變的一個有價值指標。

 

免疫學應用

流式細胞技術通過螢光抗原抗體檢測技術分析細胞表面抗原,進行細胞分類和亞群分析,此一技術對於人體細胞免疫功能的評估具有重要貢獻。例如:正常人類淋巴細胞T4:T8=2:1,但在人體免疫低下時可能出現倒置,變成1:2,T4與T8的比值也可用來監測腎移植後病人的排斥反應,此技術也可用於愛滋病的診斷和治療中。流式細胞技術也可以在血液中篩選白細胞、顆粒細胞與淋巴細胞。

 

血液學應用

流式細胞技術在血液學中,主要用於白血病的診斷和治療,利用細胞表面抗原的單株抗體並結合螢光,量測細胞的各式參數以正確判斷該細胞屬性。細胞表面抗原的專一性對於白血病診斷有決定性的作用,例如:造血幹細胞表現CD34;B細胞表現CD10、CD19、CD20等與T細胞表現CD2、CD5、CD7等。

異體造血幹細胞移植也需仰賴流式細胞技術,其中所需的幹細胞鑑別,活性測定,幹細胞採集、分離與純化等,流式細胞技術都是不可或缺的。

 

藥理學應用

多重耐藥性(Multidrug Resistance, MDR)是指對幾種自然產生的細胞毒素交叉抗性,是化療的主要障礙之一。MDR可能因為跨膜P-醣蛋白的高表達和細胞內藥物重新分配異常,而使細胞內藥物在有效部位的射入量減少。在結構方面可以檢測P-gp的高表達,在功能方面可檢測抗腫瘤藥物的細胞內積聚程度,從而判斷藥物是否有作用在正確的地方。

利用BrdU染色DNA,可以準確測定DNA合成速率,依據DNA直方圖的變化來判斷化療藥物的作用機制或療效。

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