Plasmid extraction | 原理介紹 2020/03/25

Plasmid extraction | 原理介紹

 

質體為分子生物學實驗中不可或缺的載體,質體為細胞內環狀DNA片段,在宿主細胞核外仍然能進行DNA複製,包含複製起始點 (Origin of replication)、細菌抗生素 (Antibiotic resistance gene)、細胞抗生素 (Selectable marker)、多克隆位點 (Multiple cloning site)、Insert、啟動子 (Promoter) 及引子結合位點 (Primer binding site)。

        質體製備包含三個步驟:(1)細菌培養放大 (2)菌體收集與裂解 (3)質體純化。而目前最常使用的Plasmid extraction方法為鹼性溶解法(Alkaline lysis)。以下介紹使用試劑與功用:

 

(1) Solution 1:將菌體懸浮於溶液中

成分

功用

25 mM Tris-HCl(pH8.0)

緩衝溶液,維持pH值穩定

10 mM EDTA

與微生物金屬離子結合,抑制DNase活性

50 mM Glucose

增加溶液黏稠度,避免菌體沉降,保持懸浮

RNase

降解溶液內RNA

 

(2) Solution 2:將細胞裂解

成分

功用

250 mM NaOH

細胞膜成分為磷脂類物質,利用強鹼使酯鍵斷裂,破壞細胞膜

1%(W/V)SDS

與Solution 3反應

*需要注意加入solution 2後不可劇烈晃動且時間不能過長,這會使DNA斷裂。

 

(3) Solution 3: 中和solution 2 強鹼,清除細胞內雜質

成分

功用

3M potassium acetate

與solution 2 中SDS反應,與變性蛋白質生成不溶於水之potassium dodecylsulfate (PDS),進而去除雜質

5M acetic acid

中和強鹼

 

(4) Washing buffer

成分

功用

10 mM Tris-HCl (pH 7.5)

清洗多餘鹽類

80 % Ethanol

*Washing buffer中含有高濃度乙醇,乙醇會影響DNA品質,並抑制後續的酶作用反應,在elution前需將乙醇完全去除。

 

(5) Elution buffer

成分

功用

10 mM Tris-HCl (pH 7.5)

將管柱內吸附膜上DNA沖堤至乾淨離心管中

*將elution buffer預先加熱65-70度可以提高產量。

 

 

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