ELISA | 樣品的稀釋倍率該如何決定? 2020/04/15

ELISA | 樣品的稀釋倍率該如何決定?

 

現今的ELISA Kit產品都非常的純熟,只要依照原廠提供的protocol進行實驗操作,再沒有人為疏失的情況下,大多都可以得到準確的結果。然而,最關鍵的問題其實是在於樣品濃度,由於ELISA Kit是利用抗原-抗體具有專一性的原理進行反應,因此,樣品中抗體的濃度或其他蛋白質成分過多時,可能會影響實驗數值。接下來,ACE Biolabs 依據實驗代工的經驗,提供幾點在樣品稀釋上需要注意的事項:

 

確認目標蛋白在樣品中的濃度

在知道目標蛋白後,可以參考相關文獻或其他相關資訊,得知目標蛋白會落在哪個濃度區間,同時,可以注意手中樣品的萃取方法、前處理、添加劑、狀態等,是否和文獻中的有所差異。接著,就是要選擇符合條件的靈敏度(Sensitivity)與檢測區間(Detection Range),例如:健康人類的血清中,IL-6(Interleukin 6)的含量通常<7 pg/mL(E0025, Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit, ACE Biolabs),此時就要選擇靈敏度<7 pg/mL的ELISA Kit,若選擇了靈敏度>7 pg/mL的ELISA Kit便無法得到準確的實驗結果。ACE Biolabs 提供高靈敏度、品質穩定、反應物種眾多(除了常見的Human、Mouse等,也有Porcine、Monkey、dog等)ELISA Kit 

 

如何知道樣品濃度?該將樣品稀釋嗎?

如果一開始就已知樣品中目標蛋白的濃度,還是建議先進行一次預實驗,可以先排除實驗進行中可能遇到的問題,避免浪費珍貴的樣品。

然而,大部分的樣品濃度都是未知的;在面對一個未知濃度的樣品時,前一步驟的文獻收集便更加重要,而預實驗也是一定要做的,這邊,我們有兩個建議的方向:1. 若樣品的量非常足夠,可以直接以原液進行預實驗。2. 若樣品的量非常珍貴,就需要以抗體稀釋液進行序列稀釋,序列稀釋的樣品通常是稀釋5-100倍,尤其是血清或血漿樣品,序列稀釋更是重要。血清或血漿中成分複雜,其中會含有讓抗體辨識目標蛋白的能力降低,稀釋後會降低其他物質對抗原-抗體結合的影響,反而會提高ELISA的數值。

 

 

以下就以ACEBiolabs的代工經驗,說明血清樣品稀釋的重要性:(E3742, Porcine cTnT/TNNT2(Troponin T Type 2, Cardiac) ELISA Kit, ACE Biolabs)

  

 由上面兩張圖就可以看出,1X稀釋與5X稀釋樣品所做出的實驗結果完全不同。在5X稀釋時,目標蛋白的數值反而是1X稀釋時的2倍以上,在這樣的情況下,5X稀釋後的實驗結果較具有可信度。血液中的成分太過複雜,有些非目標蛋白的物質也會搶奪抗體,反而使真正的目標蛋白無法與抗體結合,造成數值的不準確,所以,在進行血清或血漿樣品的檢測時,”稀釋”是非常重要的,然而,稀釋的最佳倍率會依據樣品的不同或目標蛋白的不同而有所差異。最後計算樣品濃度時,記得要將稀釋倍率乘回去喔!

 

樣品濃度是否符合標準曲線(standard curve)

想要知道待測樣品中的目標蛋白濃度,Standard curve絕對是最重要的一環。每個ELISA Kit中都會附上標準品,利用標準品的連續稀釋來製成標準曲線,製備標準曲線的濃度至少要有5個。標準曲線會包含無法檢測到最大訊號的濃度範圍,標準曲線完成後,就可以利用內插法算出待測樣品的濃度。

不過,可不是將標準品稀釋之後所得的數據都可以作為標準曲線喔!要判斷標準曲線有沒有可信度,還需要R2值,R2值表示的是讀值與標準曲線的對應關係,最完美的情況下是R2=1,但是,實驗難免會有誤差,所以只要R2>0.98,就是可以信賴的標準曲線。

現在大部分的ELISA Reader都有內建的standard curve生成功能,若沒有自動計算的程式,也可以用Excel或其他統計軟體進行作圖。以下,就以ACEBiolabs代工實驗實際的數據為例:(E3645, Porcine IL-1β(Interleukin 1 Beta) ELISA Kit, ACEBiolabs)。

此圖是利用M2 ELISA Reader內建程式所做的圖,一般標準曲線都像這樣,呈現S型的曲線。

 

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