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Cell culture | 細胞培養 2019/05/08

細胞培養 Cell Culture

每個實驗室都會進行細胞培養,看起來細胞培養非常簡單,但是實際上卻有許多注意事項。以前研究所時,老師曾經告訴我們,要把細胞當作「男/女朋友」,要了解他/她的需求、要每天噓寒問暖和細心呵護。也許聽起來很誇張,但是對於新進實驗室的菜鳥們,細胞培養的確是一大難題。

 

  • 了解細胞:

開始進行實驗前,必須先了解細胞的種類和培養條件,才能夠先對目標細胞有基本的認識,以及準備細胞需要的環境。

  1. 細胞種類

開始實驗前,必須先要了解細胞的身分,包含來源 (人類或老鼠)、組織來源 (肝臟或肺臟)、細胞型態 (圓球、紡錘或完全貼平) 等等。尤其是細胞的型態,用來確認細胞培養時,細胞是否生長良好。

  1. 選擇培養皿

確認好細胞的身分和培養液後,接下來要選擇細胞住的房子——細胞培養皿。實驗室看到的細胞培養皿並不是簡單的無菌塑膠而已,貼附的過程為,細胞首先分泌細胞外基質,這些蛋白質黏附在培養皿的表面,然後細胞才透過細胞膜和細胞外基質的作用黏附到培養皿底部。因此,除了細胞本身的特性之外,也和培養皿表面結構有關。以前最早的細胞培養皿材質為玻璃,但是因為不容易清潔乾淨,以及細胞貼附效果不好,通常需要表面塗層處理,因此後來改用拋棄式的塑膠。使用的塑膠材質為 polystyrene,為有苯環的長碳鏈,優點在於其光學透明性、容易塑模以及可以使用輻射殺菌。缺點卻是它非常疏水,因此會經過尖端放電或是氣體電漿處理,產生的高能量氧原子作用在 polystyrene 上,產生大量的羥基和羰基,而增加親水性。後來更加上合成的 polymer poly-lysine,提高生物相容性,增加細胞貼附和生長。市面上的細胞培養皿沒有太大差別,都可以購買使用,只不過有不同大小的培養皿,依實驗需求購買,切記不要把10 cm dish petri dish 96 well plate ELISA plate 搞混。有些實驗者會自己再黏附上 collagen Type I, fibronectin, vitronectin 等,增加細胞貼附能力。

更有趣的是,有些實驗反而會需要細胞不要貼附,就會需要購買 ultralow culture dish,這類的培養皿經過別的處理,使得表面更疏水,而使蛋白質更不容易吸附。另外,隨著組織工程的進展,開始出現立體的培養基,使研究者更能模擬出細胞在組織間的作用關係,加上 3D 列印技術的革新,許多實驗室自己就能做出目標結構的培養基。

 

  1. 選擇培養液

每種細胞有自己適用的培養液,通常可由網路上 ATCC 查詢,或是參考網友介紹也可。現在大多使用「合成培養基」,合成培養基是用化學合成方式取代天然萃取,可以確認每一種營養的濃度,確保每次使用品質皆相同。基本上包含鹽類、胺基酸、維生素等營養物質,通常適用於大部分的細胞。實驗室最常使用的是 DMEM (Dulbecco’s modified Minimal Essential Medium) RPMI-1640DMEM 還有分成低糖 (1000 mg/L) 和高糖 (4500 mg/L),還有 DMEM/F12 DMEM F12 1:1 混合。不過有些天然成分不容易用化學成分取代,所以通常還是會加入天然培養基,才能維持細胞的健康,現在普遍使用胎牛血清 (FBS),比例為5-20%,最常用的是10%

培養液有分成液態和固態粉末,液態的好處在於買來時即完成殺菌,可以直接使用,但缺點是保存時間較短;固態粉末保存時間較長,比較節省空間,價格也比較便宜,但是必須要自行配置,並且完成滅菌。兩者都是於4oC 避光保存,應避免凍於-20oC,解凍時可能會有營養成分析出,影響培養效果。另外,由於培養液含營養物質,在高溫下會失去活性,因此不能使用高壓高溫滅菌,通常使用過濾的方式去除微生物。需要注意的是,用來盛裝的血清瓶本身需要經過仔細清潔,高壓高溫滅菌後烘乾,才能夠放心盛裝過濾後的培養液。

細胞培養液通常採用 NaHCO3-CO2 緩衝系統,因此固態粉末的培養基需要按照包裝上說明添加碳酸氫鈉,而細胞培養箱也會另外給予5% CO2,穩定培養液的酸鹼值。另一種常見的緩衝液為 HEPES,為一種非離子兩性緩衝液,通常添加濃度為10-25 mM。另外,有些培養液會添加酚紅作為酸鹼指示劑,提供實驗者判斷培養液的酸鹼值。當培養的細胞數過多,會導致細胞大量排放代謝廢物到培養液中,而代謝廢物通常呈酸性,因此培養液會變成黃色,實驗者看到黃色即知道要更換培養液,或是繼代細胞。不過有些細胞實驗不適合添加酸鹼指示劑,市面上也可購買無色的培養液。亦可參考各種培養基的種類與應用

 

  1. 選擇血清

儘管科學家使用化學合成方式組合出了「合成培養基」,但是依然會額外添加「天然培養基」,現在實驗室普遍使用的天然培養基就是胎牛血清 (FBS),血清中含有各種血漿蛋白、多肽類、生長因子、激素等營養成分,這些都不容易用化學合成取代。胎牛血清優點在於營養成分豐富,培養細胞效果良好,可適用幾乎所有細胞。但是缺點在於成分複雜,批次間差異非常大,有時還有可能有病毒汙染,近年來因為人道主義等原因價格更是不斷上漲。由於血清批次間差異大,所以建議先訂購不同批次一瓶,測試有無汙染以及細胞生長情形,確認其效率後再統一訂購大量的同樣批次。另外,ACE Biolabs 提供 Fetalgro® Bovine Growth Serum (BGS) (ACE Biolabs, FGR-BBT)Fetalgro 是以小牛血清為基底的專利配方,額外添加其他營養成分,價格較便宜,且品質較穩定。

血清需要存放於-80oC 長久保存,可暫放4oC。對於大體積包裝,建議可以分裝使用。一般購買的血清均以經過無菌處理,而肉眼可見的懸浮物為蛋白質沉澱,可用離心或0.45 um 過濾去除。若想要進行無菌過濾 (0.22 um 過濾膜),則千萬不要直接過濾,蛋白質沉澱會阻擋住孔洞,造成堵塞,必須先去除蛋白質沉澱後再行過濾。血清解凍應該於4oC 搖晃一到兩天,一定要均勻規則地搖晃,使溫度變化統一,避免沉澱產生。切記不要直接拿去37oC 解凍,過大的局部溫差變化會導致大量沉澱產生,降低營養成分。通常實驗室會將血清 heat-inactivation,步驟為已經完全溶解的血清經過56oC 處理30分鐘,目的在於去除補體活性。

近年來,細胞治療蓬勃發展,培養的細胞會需要打回人體,因此實驗者需要盡量排除異種來源的產物,而研發出了人類血小板裂解濃縮液 (human Platelet Lysate, hPL)。人類血小板裂解液可以提供無異種來源的培養環境 (xeno-free),不會有異種蛋白質造成的免疫反應,其培養效果和胎牛血清相當。不過因為也是天然培養基,所以成分也是無法確定,而且可能會有人類的細菌病毒汙染問題,因此需要選擇值得信賴的供應商。需要注意的是,並不是所有細胞都同時適用不同種類的天然培養基,因此若實驗者有意願更換,需要嚴謹的測試,檢測細胞型態、生長速率,甚至是基因表現和 DNA 甲基化分析。

 

  1. 抗生素添加

很多實驗室為了預防細菌汙染,常會添加抗生素,最常用的就是 penicillin streptomycinACE Biolabs 即提供 Penicillin-Streptomycin Solution (100X) (ACE Biolabs, CC1009)。其實一般細胞培養不需要添加抗生素,某些實驗甚至會要求不要添加 (如慢病毒包裝);不過有些特殊實驗需要添加,像是從新鮮的組織中分離特殊細胞,由於一開始來源無法確定無菌,所以必須添加多種抗生素。

細胞汙染最明顯的特徵就是上清液混濁、培養液變色、細胞大量死亡,有些甚至會出現油油的感覺,一旦發現細胞汙染,則切記將其拿到細胞房外處理,不要傾倒於細胞房內水槽,避免汙染擴散。使用的培養液和其他用品都要經過測試,找出汙染源並仔細清潔。最麻煩的汙染是黴漿菌 (或稱為支原體),黴漿菌為無細胞壁的原核生物,細胞型態不固定,大小0.2-0.3 um,因此有一定機率通過0.22 um 過濾膜,造成細胞汙染。由於沒有細胞壁,因此可以對抗部分抗生素,需要使用特別的抗生素才行。感染的細胞不會死亡,沒有明顯的特徵,但是培養液可能容易變色,細胞生長緩慢,顯微鏡高倍觀察下,還可以看到奇怪的小黑點。一般檢測的方法使用聚合酶連鎖反應 (PCR),偵測黴漿菌的特定 DNA 片段,以電泳確認,通常直接取培養幾天細胞的上清培養液即可。ACE Biolabs 提供 Mycoplasma Detector (ACE Biolabs, CM1001),不需要跑電泳,僅通過肉眼觀察顏色變化即可,還附上 positive control 做顏色的比對。

 

  1. 其他添加

有些細胞會有特殊需求,如 glutamategrowth factor 等等,實驗室舊有的細胞按照實驗室習慣培養,而新的細胞需要於網路上查詢,添加建議的營養。有些細胞於官網 ( ATCC) 會建議過多或是過於昂貴的添加物,此時可查詢一般網頁,或是可先嘗試一般的培養條件,如果細胞生長情況皆正常 (型態和生長速度),則可以改用其他條件。

 

  • 無菌操作注意事項:

確認好細胞種類和培養環境需求後,開始進入實驗室操作,首先要注意的就是「保持乾淨」,因為一不小心就有可能將數個月的心血全部白費。通常實驗室會有一間「細胞房」,擺放細胞專用的一些設備,包含離心機、自動吸量管 (autopipette)、微量吸管 (pipetman) 等,避免和細菌實驗共用設備而導致汙染。需要特別注意細胞操作檯、細胞培養箱和二氧化碳鋼瓶。

  1. 進入細胞房後,先戴上手套,以70% 酒精擦拭後才開始進入操作檯操作。過程中若有移動到外面,接觸操作檯以外物品,皆需要以70% 酒精擦拭,保持乾淨。
  2. 細胞房定期 (建議每周) 擦拭操作檯外面桌面和地板,並開啟細胞房 UV,照射消毒一個晚上。

 

  1. 細胞操作檯

細胞操作會在「生物安全操作檯 (Biological Safety Cabinet, BSC) (class II)」進行,和一般的「化學抽氣櫃」或「無菌操作檯」不同。化學抽氣櫃是負壓,避免化學物質滲透到外面空氣中;而無菌操作檯則是正壓,由外界吸入空氣,經由高效率過濾網 (HEPA) 過濾後,將乾淨的空氣送出,避免外在空氣微生物進入。生物安全操作檯是內循環系統,由外界吸入並過濾的空氣,會在操作檯前後兩端被吸入,並不會流到外面,因此操作檯內外的空氣完全隔離。這樣的好處在於除了可避免外界微生物進入汙染,同時也可以避免內部感染性生物 (如病毒) 暴露到外界。而維持穩定的氣流需要控制拉門在特定高度,過高或高低皆會導致氣流不穩定,影響安全狀態。比較舊型的生物安全操作檯沒有自動化系統,必須由人力判斷高度,通常會在拉門下緣貼上一張紙條,正確的高度會讓紙條水平浮起。新型的操作檯會自動偵測,錯誤的高度會使系統發生警報聲,因此較容易判斷。

  1. 操作檯開始使用前,先以70% 酒精擦拭平面,並讓風扇運轉5分鐘以上,使氣流穩定。
  2. 所有實驗用品都必須先以70% 酒精擦拭過,才能放入操作檯裡面。
  3. 裡面物品的擺放不應過度壅擠而阻擋氣流的流動,如果有很多實驗,應該分階段移入物品,不要一次全部移入。
  4. 取用無菌溶液和操作細胞時,打開蓋子後應盡快蓋回,並且在開蓋過程中,盡量避免經過上方。
  5. 實驗完畢後,以70% 酒精擦拭平面,並開啟 UV 照射半小時以上。新型機器可設定時間,舊型需要手動關閉。
  6. 一些常用室溫物品可以放置於操作檯裡面,如自動吸量管、微量吸管、吸管 (tip)、管子架子等,但要應避免塑膠類物品受 UV 長時間照射,造成塑膠老化 (每次使用完照射半小時即可)
  7. 注意氣流壓力,定期更換紫外線燈管和過濾網。

 

  1. 細胞培養箱

細胞培養箱有完整的偵測功能,能夠精準地控制溫度和二氧化碳濃度,新型的培養箱甚至可以設定濕度,以及可以內部滅菌 (記得要移走細胞和特定物品)。如果無法控制濕度,則通常會放置水盤以維持足夠的溼度,避免培養液蒸發造成鹽類劇烈變化,影響細胞生長。水盤應使用高壓滅菌過的二次水,並定期清洗更換。平常使用時,要注意二氧化碳濃度、溫度及水盤是否有污染。

  1. 水浴槽

細胞培養液通常儲存於4oC環境,保持培養液中營養成分,因此使用前必須回溫。通常細胞培養溫度為37oC,因此會使用水浴槽加熱培養液至相同溫度,才開始進行實驗。水浴槽使用一次水即可,並添加抗菌劑,延長使用使間。使用時要注意,不要讓水平面低於加熱棒,以免發生危險。切記要定期清洗,保持乾淨。

  1. 二氧化碳鋼瓶和氮氣鋼瓶

若細胞培養基以碳酸鹽為 pH 緩衝系統,則需補充二氧化碳以達到緩衝作用,通常設定在5%,遠高於自然環境中的濃度,因此需要另外提供二氧化碳。有些實驗因為特殊需求需要低氧環境 (<20%),此時會使用氮氣取代空氣,降低氧氣濃度。兩種氣體使用的鋼瓶為了安全,必須固定於牆上,並且準備兩個,一個備用。

 

  1. 細胞實驗用品無菌處理

通常購買的細胞培養皿和使用的溶液皆已經經過無菌處理,其他自行配置的物品必須先經過無菌處理,才能夠處理細胞。無菌處理的方式有高壓蒸氣滅菌法 (濕式滅菌)、乾熱滅菌 (乾殺) 及過濾除菌。

  1. 高壓蒸氣滅菌法 (濕式滅菌)

使用高壓滅菌釜,在高壓飽和水蒸氣作用下,120oC 作用15-20分鐘。適用於耐高溫的容器及不會因高溫破壞成分的溶液。

  1. 乾熱滅菌 (乾殺)

使用烘箱,170-180oC 作用1-4小時。適用於玻璃器皿 (如玻璃吸管),滅菌完即可使用,不需要等待烘乾時間。

  1. 過濾除菌:

多數營養成分會因為高溫作用破壞活性,因此只能用過濾法滅菌。使用0.22 um 孔徑的過濾膜,使用針筒連接推入液體,出口處即為無菌狀態。作用原理在於0.22 um 孔徑小於病原體,因此可以去除微生物。需要注意,不同種類溶液要選擇不同過濾膜,實驗室常見的 polyethersulfone (PES) 可以過濾大部分的水溶液,但是千萬不能拿來過濾有機溶液。

 

  • 一般細胞培養:

了解細胞生長條件,以及能夠正確地保持無菌操作後,接下來進入到細胞培養。細胞一般培養可分成三部分,解凍細胞、一般培養以及冷凍細胞,熟悉三個步驟的操作後,才能夠獨立操作細胞實驗。

 

  1. 解凍細胞

細胞通常保存於液態氮裡,拿取細胞凍管時需要注意安全。拿取前必須加熱水浴槽至37oC,並溫熱好細胞用培養液。拿取細胞凍管後,應「迅速」放入水浴槽中,快速回溫。如果於常溫回溫,微觀來看,細胞凍管最外層會先溶化,此時內部依然處於低溫,所以又會使外層溶液凝固,造成細胞溶液反覆凍溶,造成不可回復的損傷。因此,需要以37oC 快速回溫,降低細胞損傷。

通常細胞冷凍液含有高濃度 DMSO,因此解凍細胞時至少要以培養液稀釋10倍,並且於隔天更換培養液。為了避免 DMSO 殘留,也可以離心去除 (300 g 3-5分鐘),重新以培養液懸浮細胞。由於細胞剛於特殊環境中回復,因此必須等待一至兩周的時間 (中間需要繼代),細胞生長和特性才會恢復正常,此時才能夠進行細胞實驗。

 

  1. 一般培養

開始培養細胞,需要練習細胞一般的繼代、細胞計數和觀察細胞生長情形。

  1. 細胞繼代

細胞培養至高密度時,必須收集細胞更換至新的培養皿,即一般稱作「繼代」。對於貼附型細胞而言,需要破壞細胞和培養皿之間的連結,通常使用 trypsin-EDTA 處理。胰蛋白酶 (trypsin) 可以破壞細胞和培養皿之間的蛋白質連接,而 EDTA 則可以螯合 Mg2+ Ca2+,這些二價離子為細胞之間連結蛋白的輔因子,因此 trypsin-EDTA 可以「切」下細胞。去除掉舊的培養液後 (通常使用吸引器 suction),由於培養液中的血清會抑制胰蛋白酶作用,因此會先以約培養液一半體積的 PBS 清洗細胞表面。去除 PBS 後再加入約1/10培養液體積的 trypsin-EDTA,於培養箱中反應數分鐘。Trypsin-EDTA 濃度常使用0.05%,視情況可以調整濃度,而時間常為1-10分鐘,視細胞種類而定。新接觸的目標細胞建議每1-2分鐘拿出來,於顯微鏡下觀察,成功切下而懸浮的細胞會成圓形,前幾次確認好時間後,以後都固定的時間即可。之後,加入適量的培養液中和 trypsin-EDTA,並取部分細胞液至新的已加入新鮮培養液的培養皿中,搖晃使細胞均勻分布,可採取上下左右搖晃或是8字搖晃,切忌避免使用圓圈式搖晃,容易使細胞聚集在中間。

細胞繼代的比例依據細胞種類有所不同,新的目標細胞建議嘗試多種比例。新的目標細胞建議進行細胞計數後,取一定的細胞數繼代。一般來說,多數細胞三天大概增加為10倍,因此繼代數目為滿盤細胞數的1/10。要注意的是,不同細胞的大小不同,造成滿盤細胞數有所差異,通常培養皿的廠商會提供滿盤細胞數,但是實際上要自己確認。像是纖維母細胞可能細胞較大,因此滿盤細胞數可能較少。大部分細胞對於 trypsin-EDTA 有一定的耐受性,但是若最後細胞液中 trypsin-EDTA 比例大於1/10,或是比較敏感的細胞,則需要先離心 (300 g 5分鐘) 去除上清液,再以培養液懸浮。懸浮型細胞則直接吸取細胞溶液,以離心 (300 g 5分鐘) 去掉上清液後,以新鮮的培養液重新懸浮,再取適量的細胞繼代即可。

 

  1. 細胞計數

剛接觸新的細胞,或是要進行細胞實驗時,會需要計算細胞濃度,可以使用傳統的血球計數器或是自動計數器。自動計數器雖然方便快速,但是無法分辨死亡細胞和黏在一起的細胞,因此會有些微誤差。血球計數器有兩個計算槽,每一個計算槽刻劃91 mm2 的正方形。當放入10 uL,蓋上蓋玻片時,液體的深度為0.1 mm,因此每一個正方形體積為 0.1 mm3,即為10-4 mL。因此,使用肉眼計算一個正方形的細胞數,除以10-4 mL (或乘以104/mL),即可算出細胞濃度 (/mL)。實際上為了更加準確,通常會計算四個角落正方形的細胞數,取平均後再做計算。

另外,為了分辨活細胞,通常會加入 trypan blue (0.4 % Trypan Blue Solution (ACE Biolabs, CC1005)),此染劑只能通過死亡細胞的細胞膜,因此死細胞會和背景同顏色 (),活細胞則是中間澄清無色。計算時,只計數活的細胞,最後記得要乘上稀釋倍率。舉例來說,取20 uL 細胞液加入20 uL trypan blue,混合均勻後放入10 uL,計算四格細胞數共100顆細胞,因此原本細胞液的濃度就是100÷4×104×2 =5x105/mL。要注意血球計數器和自動計數器都有限制細胞濃度,過濃的話要先以培養液或 PBS 稀釋,過稀的話則必須先離心細胞液,以較少體積的培養液懸浮以增加濃度。

 

  1. 細胞生長情形

細胞於培養皿中生長的速率並非相同,分成延遲期 (lag phase)、指數期 (log phase) 和穩定期 (stationary phase)。細胞剛種下時,會需要重新分細胞外基質、修復胰蛋白酶造成的損傷、重組細胞骨架、建立細胞之間連結等等,此階段生長較緩慢,稱為延遲期。不同細胞需要的時間不同,數小時到兩天都有,要仔細觀察目標細胞的變化,一般來說是以細胞全部貼附當作基準。接下來,細胞開始快速生長分裂,即進入指數期。此階段的細胞最有活性,因此大部分的藥物測試實驗會在此階段進行。最後,當培養液中的營養成分消耗殆盡,或是沒有細胞生長的空間 (培養皿),細胞就會進入穩定期。大部分細胞停止分裂,時間一久,培養液中代謝物累積過多,會造成細胞死亡。不同細胞的階段時間皆不相同,可以使用 CCK-8 Cell Counting Kit (ACE Biolabs, CC1007) 測定細胞生長情形。

 

  1. 冷凍細胞

有些細胞的處理花費時間較長 (如製作穩定細胞株) 或是花費較貴,或是純粹是增加實驗室細胞庫存,都需要冷凍細胞保存。目標細胞應處於健康的狀態 (不健康的細胞冷凍後還是不健康),並且處於生長活躍期 (8-9成滿),千萬不要過滿導致細胞生長停頓 (如果不小心過滿,則先行繼代,下一次再冷凍)。冷凍細胞使用的保存液建議新鮮配置,通常使用培養用的培養液,添加5-10% DMSO,搭配30-50% FBS。細胞濃度建議1-5x10^6 cells/mL,一管1 mL。細胞冷凍用的管子被稱作「冷凍小管」,是內旋式蓋子,可以避免因為冷凍解凍造成的溫差而爆裂。實際操作和一般培養步驟相同,取適量細胞離心 (300 g 3-5分鐘) 去掉上清後,以保存液懸浮細胞,分裝到冷凍小管中,放入「漸凍盒」,並放入-80oC,隔天移到液態氮裡。注意細胞只能暫放-80oC,長期需要保存於液態氮中。

細胞冷凍的過程和解凍相反,需要足夠「緩慢」,「漸凍盒」的目的在於此。「漸凍盒」通常會添加「異丙醇」,因為剛好異丙醇降溫速率約為每分鐘1度。而在這個過程中,細胞外的水會先開始凝固,此時 DMSO 可以破壞水的結晶,使水結晶不會過大而破壞細胞膜。同時,細胞內的水分會滲透到膜外,細胞失去水分而成扁平狀,所有代謝反應也將停止,進入休眠狀態。要注意的是,異丙醇每使用約五次就要更換,因為即使是在低溫,冰箱中的水分也會進入異丙醇中,改變其濃度,造成降溫速率太快,差不多五次會到達極限,因此需要更換。

最後,細胞實驗需要注意很多事情,所以除非時間緊迫,否則建議安排足夠的時間,讓實驗者能有充分的時間處理細胞,千萬不要因為趕時間,導致汙染造成前功盡棄。同時,細胞實驗也需要專心一致,實驗者需要注意自己的精神和身體狀態,保持良好心情進入細胞房。

 

 

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