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Cell culture | 細胞汙染防治與清潔 2019/11/13

細胞汙染防治與清潔

 

細胞汙染是細胞培養最嚴重的問題,不僅會影響細胞生長速度,更嚴重的會造成細胞型態的差異,最後,就是使細胞死亡。對於細胞培養新手來說,細胞汙染是一大威脅,時常會花很久的時間來找出汙染原因,但是,在此期間汙染可能會不段擴大。相信每間實驗室或多或少都發生過細胞污染的情形,即使再小心翼翼,也總會有”意外”發生的時候。

如何預防細胞汙染--

  • 確認器具的清潔:

開始細胞培養前,所有會接觸到細胞的藥品、耗材或器具等,都必須是無菌的。

  1. 培養基(Medium)

選擇符合細胞的培養基固然重要,然而,培養基的乾淨程度是最直接影響細胞生長的,因此,培養基的配置方式是非常重要的,以下為ACE Biolabs 提供的方法:

  • 若購入之基本培養基(basal medium)為粉末包裝,建議於配置兩天前,將血清瓶以一次水清洗三次、二次水清洗三次,於瓶口包覆鋁箔紙並貼上滅菌膠帶(寫上日期),高溫高壓滅菌完成後置於烘箱烘乾。配置基本培養基所使用的二次水,建議當日取用純水機所製造出來的二次水,以確保水源乾淨。粉末狀的基本培養基以二次水完全溶解後,需確認其pH值為7.2-7.4,接著在無菌操作台中以0.22 μm 濾杯(Thermo, 500 mL, 595-4520)過濾培養基至無菌血清瓶中。 完成後,取2 mL 基本培養基至3.5 cm 無菌培養皿中,存放於一般細胞培養環境(37°C, 5% CO2)中三天以上,每天觀察培養基狀態。若培養基變混濁或顯微鏡下觀察到雜質或微量的菌即為有汙染,需重新過濾或是捨棄該批培養基並且將環境重新清潔乾淨。

 

  • 基本培養基(basal medium)加入血清後,也需要取2 mL培養基,至3.5 cm 無菌培養皿中,存放於一般細胞培養環境(37°C, 5% CO2)中三天以上,每天觀察培養基狀態。若培養基變混濁即為有汙染,顯微鏡觀察下若發現雜質但是不會動或增加,屬正常現象。血清含有很高的營養物質,會讓細菌快速繁殖,造成細胞汙染,所以培養基無菌測試建議放三天以上,確認medium澄清再進行使用。
     
  • 無菌測試所取用的2 mL培養基,需存放於細胞培養環境,直到此瓶培養基完全使用完皆為澄清,表示此瓶培養基配置過程是乾淨無菌的。

 

  1. 血清

血清長久保存需要存放於-80oC ,購入時通常是500 mL或1 L的包裝,對於大體積包裝,建議可以分裝使用。一般細胞培養所用的血清都已經經過0.1μm過濾處理,肉眼可見的懸浮物為蛋白質沉澱,可用離心或0.45 μm 過濾去除。血清解凍應該於4˚C 緩慢退冰,約需要1-2天,千萬不要直接拿去37˚C 回溫,過大的局部溫差變化會導致大量沉澱產生,降低營養成分。

 

  1. 耗材/耐高溫器皿

耗材類的物品都需要以高溫高壓滅菌(通常為121˚C, 30 min)並放60˚C烘箱烘乾。可滅菌的器具,例如:血清瓶、燒杯等,也可用高溫高壓滅菌來達到無菌的效果。

 

  1. 藥品

細胞實驗最常用的藥品不外乎就是1x PBS、Trypsin或是抗生素。ACE Biolabs 提供10x sterile PBS (C1015, ACE),只需要以無菌水稀釋至1x即可使用;Trypsin和抗生素通常包裝即為無菌,以自己需要的濃度稀釋即可。用於細胞實驗的藥物待完全溶解後,以0.2μm的filter過濾液體,以達到無菌的效果,若是非無菌情形下配置的PBS,可以直接以高溫高壓滅菌或是0.2μm的filter過濾。

  

  • 無菌操作注意事項:

細胞室操作首先要注意的就是「保持乾淨」,細胞室的設備最好都是細胞專用,包含離心機、自動吸量管 (autopipette)、微量吸管 (pipetman) 等,避免和細菌實驗共用設備而導致汙染。需要特別注意細胞操作檯、細胞培養箱和二氧化碳鋼瓶。

  1. 進入細胞房後,先戴上手套,以75% 酒精擦拭後才開始進入操作檯操作。過程中若有移動到外面,接觸操作檯以外物品,皆需要以75% 酒精擦拭,保持乾淨。
  2. 細胞房定期以稀釋的漂白水、次氯酸水或是生物實驗室專用的去汙染消毒噴劑 (CE1024 ACEcleaner Disinfectant Spray) 擦拭操作檯外面桌面和地板(建議每週1-2次),若細胞是裝有UV燈,每週至少一次開啟細胞房 UV,照射消毒一個晚上。
  3. 細胞培養箱的水盤需要定期清理(建議每週一次),並加入水浴槽抑黴劑(CE1023 ACEcleaner Disinfectant Concentrate)。
  4. 恆溫水槽需要定期清理(建議每週一次),並加入水浴槽抑黴劑(CE1023 ACEcleaner Disinfectant Concentrate)。

 

細胞操作會在「生物安全操作檯 (Biological Safety Cabinet, BSC) (class II)」進行,和一般的「化學抽氣櫃」或「無菌操作檯」不同。化學抽氣櫃是負壓,避免化學物質滲透到外面空氣中;而無菌操作檯則是正壓,由外界吸入空氣,經由高效率過濾網 (HEPA) 過濾後,將乾淨的空氣送出,避免外在空氣微生物進入。生物安全操作檯是內循環系統,由外界吸入並過濾的空氣,會在操作檯前後兩端被吸入,並不會流到外面,因此操作檯內外的空氣完全隔離。這樣的好處在於除了可避免外界微生物進入汙染,同時也可以避免內部感染性生物 (如病毒) 暴露到外界。而維持穩定的氣流需要控制拉門在特定高度,過高或高低皆會導致氣流不穩定,影響安全狀態。比較舊型的生物安全操作檯沒有自動化系統,必須由人力判斷高度,通常會在拉門下緣貼上一張紙條,正確的高度會讓紙條水平浮起。新型的操作檯會自動偵測,錯誤的高度會使系統發生警報聲,因此較容易判斷。

  1. 操作檯開始使用前,先以75% 酒精擦拭平面,將會使用到的培養皿、微量吸管或tip等放入,開啟UV燈照射15分鐘以上,再讓風扇運轉10分鐘以上,使氣流穩定。
  2. 所有實驗用品都必須先以75% 酒精擦拭過,才能放入操作檯裡面。
  3. 裡面物品的擺放不應過度壅擠而阻擋氣流的流動,如果有很多實驗,應該分階段移入物品,不要一次全部移入。
  4. 取用無菌溶液和操作細胞時,打開蓋子後應盡快蓋回,並且在開蓋過程中,盡量避免瓶蓋或手經過上方。
  5. 實驗完畢後,以75% 酒精擦拭平面,並開啟 UV 照射半小時以上。
  6. 一些常用室溫物品可以放置於操作檯裡面,如自動吸量管、微量吸管、吸管 (tip)、管子架子等,但要應避免塑膠類物品受 UV 長時間照射,造成塑膠老化 (每次使用完照射半小時即可)。
  7. 注意氣流壓力,定期更換紫外線燈管和過濾網。

 

如何觀察細胞汙染-- 

  • 細胞汙染情形: 

細胞最常見的汙染為細菌或真菌汙染,會造成培養基混濁、細胞死亡,但因肉眼可見明顯變化,所以容易被察覺,最可怕的是那些不易被察覺的汙染源,例如:黴漿菌。

 

  • 平時觀察細胞是否汙染
  1. 觀察medium有無變混濁。
  2. 觀察medium是否很快變黃
  3. medium中通常都有加入酚紅,依據酸鹼值變化會有不同顏色,方便細胞培養時掌握細胞養份是否足夠,若medium很快變黃,但細胞卻沒有滿盤,表示medium中的養份是被汙染源吃掉了,會使細胞得不到養份而逐漸死亡。
  4. 以顯微鏡觀察細胞生長速度或形態是否正常。
  5. 通常真菌或細菌汙染都很容易會被發現,但是黴漿菌卻是無法用顯微鏡觀察出來的汙染源。黴漿菌會貼附在細胞表面,與細胞共生存,到了後期會改變細胞外觀,影響其基因表現。
  6. 每次擴盤前皆取1 mL medium,定期或有疑慮時檢測黴漿菌。

 

  • 發現細胞汙染,首先要做的是?
  1. 將汙染的細胞與乾淨的細胞隔絕,避免汙染擴大。
  2. 重新取2 mL培養基至3.5 cm 無菌培養皿,做無菌測試。(即使一開始的無菌測試是乾淨的,也有可能在使用過程中被汙染。)
  3. 進行黴漿菌檢測 (CM1001 Mycoplasma Detector)。

 

  • 如何確定被什麼汙染?
  1. 細菌汙染:Medium混濁變黃,肉眼可見。在顯微鏡底下可看見移動或原地抖動的黑色圓點,會貼附在培養皿上,競爭細胞生存空間與養份,一般可用抗生素抑制。若要確定是否為細菌汙染,可吸取上清液用agarose培養,觀察是否形成菌落。
  2. 黴菌汙染:Medium澄清,顯微鏡底下無雜質,在細胞培養箱2-3天會出現絮狀雜質,可見明顯菌絲,會使細胞活性減低。若要確定是否為細菌汙染,可吸取上清液用agarose培養,觀察是否形成菌落。
  3. 黴漿菌汙染: Medium澄清,顯微鏡觀察不到,初期與細胞共生共存。黴漿菌會貼附於細胞表面,漸漸影響細胞基因表現,後期則會改變細胞型態。黴漿菌汙染難以察覺,通常要到後期,細胞型態改變才會發現。ACE Biolabs 提供方便、快速的黴漿菌檢測試劑(CM1001 Mycoplasma Detector),只需要1 μL培養細胞後的medium,一小時後即可知道是否汙染。抗生素對其無效。
  4. 黑膠蟲汙染: Medium澄清,顯微鏡低倍率觀察底盤乾淨,200-400x可觀察到抖動的小黑點,會懸浮在medium中,與細胞共生。目前黑膠蟲汙染尚有爭議,一部分人認為黑膠蟲是存在於牛血中的原生生物(似草履蟲),另一部分人認為,這只是細胞脆片或是血清中蛋白質的布朗運動。抗生素對其無效。
  • 確定汙染源後的處理方法:

無論汙染源為何,為了避免汙染擴大,都需要徹底清理細胞室。

  1. 無菌操作台、incubator、恆溫水槽、顯微鏡等,都需要以稀釋後的漂白水擦拭後再以75%酒精擦拭,整個細胞室都需要仔細清潔。若為黴菌汙染,須用硫酸銅水容液擦拭。
  2. Incubator中的層板、鐵架、水盤皆須要拆下來清潔,依照以下順序進行清潔:稀釋後的漂白水擦拭三次、無菌水擦拭三次、75%酒精擦拭三次。若細胞室有UV燈可以將層板、鐵架與水盤放置桌上開UV燈,無UV燈則放入無菌操作台照UV。
     

不同汙染源之解決方法:

  1. 細菌、黴菌、真菌汙染:清除全部被汙染細胞,清潔所有器具以及環境,並確認所使用培養基為無菌後,方可重新解凍細胞。
  2. 黴漿菌汙染:抗生素對黴漿菌無效。對付黴漿菌需使用其專用的抑制劑(CM1003 Mycoplasma Cleaner)。每次更換培養基時皆須加入黴漿菌抑制劑,並取1 μL檢驗黴漿菌殘留,直到未再檢出黴漿菌。
  3. 黑膠蟲汙染:黑膠蟲稱Nanobacteria,抗生素對其無效,目前無公認有效的根除方法,只能利用其會懸浮在培養液中的特性,在每次擴盤時以重複離心、PBS清洗的方式減少黑膠蟲汙染。
     

細胞汙染防治與清潔相關產品--

Cat. No.

Product Name Size
CM1001 Mycoplasma Detector 20 tests
CM1002 Mycoplasma Detector 50 tests
CM1003 Mycoplasma Cleaner 100ul
CM1004 Mycoplasma Cleaner 500ul
CE1023 ACEcleaner Disinfectant Concentrate 250 ml
CE1024 ACEcleaner Disinfectant Spray 300 ml
CE1025 ACEcleaner Disinfectant Spray - Refill 1L

 

 

參考資料

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC20966/

https://kknews.cc/zh-tw/home/jm4392y.html

https://world.taobao.com/item/558247677546.htm

https://www.hanbio.net/cn/articles/item/430281

http://zfdows.com/h-pd-195.html

 

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