Cell culture | 細胞凍存 2020/05/20

Cell culture | 細胞凍存

細胞凍存最常用的技術是液態氮冷凍保存法，為了保存不易獲得的細胞株，因應不同的細胞貼覆及細胞生長狀態，採用不同的冷凍法凍存細胞，以下提出幾個細胞凍存需注意的面向。

細胞狀態

1. 細胞應處於生長旺盛、最健康的時期（log phase），可使往後在解凍細胞時獲得健康且生長快速的細胞。
2. 細胞應為乾淨無汙染狀態。可借由顯微鏡觀察是否有細菌或是真菌的污染，並搭配Mycoplasma Detector 來偵測細胞是否遭受黴漿菌的污染。
3. 細胞應保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
4. 冷凍保存之同時，亦應作一個 backup culture，若冷凍失敗，仍有預留之細胞存在。
5. 冷凍保存之細胞濃度：1~5 x 10⁶ cells/ml

凍存劑的選擇

1. Dimethyl sulfoxide (DMSO), Cell Culture Grade，無色且無菌。凍存細胞前需先配製冷凍保存溶液：將DMSO加入新鮮培養基中，使其最終濃度為5~10％，混合均勻，置於室溫下待用。若是DMSO濃度過高，增加細胞毒性，可以降低濃度；使用血清比例增高凍存細胞，亦具有保護作用；易分化的細胞則需要降低DMSO濃度或是使用毒性較低的凍存液。
2. 特殊的凍存保護劑，例如凍存幹細胞等細胞株，需使用無血清來源搭配特殊配方，保護細胞在凍存過程中不受傷害，並降低其細胞自體分化現象。
3. 凍存液應用於細胞治療: 細胞治療產品開發，注重凍存液的效能，及凍存液成分是否可能對人體產生安全性的疑慮，DMSO於部分的動物實驗及臨床實驗中證實可能會造成導致副作用的發生，包含頭痛、噁心或腹瀉等症狀，另一個案例為間質幹細胞(MSC)於幹細胞開發治療應用中，MSC經過冷凍解凍過後，細胞代謝及表面標記有明顯減少，所以細胞凍存中，減少細胞損傷更為重要，目前有不含DMSO的細胞凍存液，但如果是應用在臨床上需要具一定的合規性及安全性，使法規單位審查，另外也需要提出實驗的數據來佐證細胞凍存液的安全性以及有效性綜合評估。

冷凍管的選擇

常見使用的冷凍管分為玻璃及塑膠製作的冷凍小管，玻璃的缺點是每次使用需要滅菌，塑膠的冷凍小管因蓋子內旋性及外旋性分成兩種，內旋性放入液態氮中較容易滲漏液態氮進去，需要旋緊，塑膠的冷凍小管，應具塑膠墊片，防止滲漏液態氮進去細胞影響復甦存活率

溫度造成細胞凍存影響

常見的凍存設施及手法，於操作時可先將DMSO放置於四度冰箱預冷，凍存細胞步驟中，較不會產生瞬間放熱產生細胞損傷。凍存細胞加入凍存液體時，需緩慢加入細胞。於凍存階段，放置於品質佳的漸凍盒可避免過快的降溫，使冰晶造成細胞破裂及永久性的損傷，影響細胞復甦存活率。理想的速率大約是1分鐘降1^oC。

細胞凍存步驟

1. 材料：
   1. 新鮮培養基
   2. DMSO
   3. 無菌塑膠冷凍保存管
   4. -20℃ 冰箱
   5. -80℃ 冰箱
   6. 程式降溫機 (可有或無)
2. 步驟：
   1. 冷凍前應注意細胞生長情形，可在一日前更換半量或全量培養基。
   2. 配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將DMSO加入新鮮培養基中，使其最終濃度為5~10％，混合均勻，置於室溫下待用。
   3. 依細胞繼代培養之操作，收集細胞，並取少量細胞懸浮液計數細胞濃度及凍前存活率。
   4. 將收集之細胞離心1000 rpm、5分鐘後，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，混合均勻後，使細胞濃度為1~5 x 10⁶ cells/ml，分裝至冷凍保存管中， 每管分裝 1 ml。
   5. 冷凍保存方法 1：冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
   6. 冷凍保存方法 2：冷凍管置於已設定程式之程式降溫機中，以每分鐘降1~3℃速率降至-80℃以下，然後放入液氮槽之vapor phase長期儲存。

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