Western-blotting | 如何選擇抗體? 2020/01/08

Western-blotting | 如何選擇抗體?

為了獲得理想的 Western-blotting 實驗結果,抗體的選擇非常關鍵。

同一個目標蛋白,市面上各廠牌各自擁有不同的抗體,面對玲瑯滿目的抗體,要如何篩選,才能選中滿意的抗體?

首先,請先確認抗體的基本資訊是否符合您的實驗需求

  1. Application

    抗體可以應用的實驗包括 WB、ELISA、IHC、IF、IP、FCM等,抗體說明書上列出該支抗體能應用的實驗。多數抗體能辨認變性蛋白,亦有設計專門辨認非變性蛋白或是蛋白表面的抗體。而 WB 實驗為凝膠電泳後轉印至膜上的變性蛋白,所以務必挑選Application 寫上 WB 的抗體。

  1. Reactivity

    製造抗體所使用的抗原通常為某一物種的重組蛋白或是合成胜肽鏈,經由實驗測試或是序列比對可以分析該抗體能辨認來其他物種的同源蛋白。例如:人類(Human)、大鼠(Rat)、小鼠(mouse) 的氨基酸序列具有高度相似性,使用人類目標蛋白為抗原所產生的抗體便有很高的機率能辨認大鼠及小鼠的同源蛋白。若是您的目標蛋白來源物種未列出,亦可經由序列比對推測該抗體能否辨認您的目標蛋白。

  1. Host species

選擇抗體的來源物種時,最好避免與您的樣品為相同物種。如此可避免二級抗體辨認一級抗體時辨認到您的樣品中原有抗體。例如:您的蛋白樣品為小鼠組織萃取物,則建議挑選來源物種為兔子的抗體。若無法避免,二抗辨認到樣品內源性的IgG,將在WB上的 50 kDa 25 kDa位置呈現條帶訊號。不過,如果您的蛋白樣品並不含有內源性IgG,例如:培養細胞萃取物,抗體來源物種的挑選則不太影響WB結果。

在實驗設計上,也可利用挑選抗體來源物種在同一張 WB membrane 上偵測兩種以上的目標蛋白。例如Akt Antibody的來源物種為兔子、β-actin Monoclonal Antibody(5B7) 的來源物種為小鼠,偵測完 AKT 的訊號後將membrane洗脫,再偵測β-actin 訊號,Anti-mouse IgG二級抗體無法辨認Akt Antibody一級抗體,如此可避免兩個目標訊號交叉反應。

  1. Clonality

    單株抗體批次間的專一性、靈敏度較為一致,抗體辨認抗原單一表位 (antigenic epitope),專性高且背景低。多株抗體則可辨認抗原上多數表位,提供較強的訊號,抗體可適用多種物種的抗原,但可能有專一性較差、背景較高的狀況。

 

  1. Antibody purification

    常見抗體純化方式為以protein A/G與抗體的Fc區域專一性結合,可有效從血清中純化出IgG,但無法更進一步區分具有專一性的IgG。

    為了純化具有專一性的IgG,ACE Biolab採用抗原親和性管柱進行抗體純化,是使用大量抗原目標抗原與凝膠介質鍵結後,具有專一性的抗體結合抗原,排除不具專一性的抗體,用以純化出高專一性的抗體。抗原親和性管柱純化方式與Protein A/G 純化方式的差別在於,前者與抗體的可變區域 Fv 專一性結合,後者與抗體的保守區 Fc 結合。相較之下,抗原親和性管柱純化出來的每個抗體蛋白皆能夠與抗原高度專一性結合,此方法應用於純化多株抗體,可有效解決多株抗體專一性較差、背景較高的狀況。

挑選出適合的抗體之後,也請您先參考技術文章 Western-blotting | 流程整理,從蛋白質收集到最後上機拍照,Western-blotting 的每個步驟都為您詳盡介紹,確認實驗過程中的每一步驟再開始進行實驗。若您在實驗進行時遇到問題,您可以參考西方點墨法常見問題 ( Western Blot ),已為您整理出常見問題及處理方式。

 

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