Antibody, Chemicals, Enzyme, ELISA / Assay kits 一站式實驗服務平台

Western-blotting | 流程整理 2019/03/05

細胞生物性實驗中,常常會需要檢測目標蛋白質的變化,可能是給予細胞某些刺激,或是調控細胞內基因的變化,而最簡單的方法就是西方墨點法 (Western-blotting)。此方法步驟大致包含:

  1. 蛋白質收集
  2. 蛋白質前處理
  3. SDS-PAGE (含膠體配置、蛋白質樣本上樣、電泳)
  4. 轉印 (transfer)
  5. 封閉 (blocking)
  6. 一級抗體反應 (primary antibody incubation)
  7. 二級抗體反應 (secondary antibody incubation)
  8. 上機紀錄結果

 

  • 蛋白質收集:

蛋白質樣本來源有很多種,包含動植物組織、血液和細胞,動植物組織因為含有很多細胞外間質 (extracellular matrix, ECM),所以必須先使用液態氮研缽或是使用磁珠法磨碎組織,再加入裂解液破壞細胞。而細胞可以直接使用裂解液收集蛋白質。一般裂解液是透過兩性清潔劑 (detergent) 破壞細胞膜,而得到細胞內的蛋白質。組織使用的裂解液通常具有比較多種的兩性清潔劑,而且濃度通常較高。裂解液配方很容易在網路上查到配方,也可以使用 ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020)

磨碎的組織或是細胞先以冰過的 PBS 清洗過一次 (可以使用 ACE Biolabs 10XPBS (C1015) 或是 20X PBS Buffer (C1037) 稀釋)。再加入適量的裂解液,均勻混合。通常會一同加入蛋白酶抑制劑 (ex: 100X Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free) (ACE Biolabs, A1029)) 抑制蛋白酶作用,如果之後要分析蛋白質的磷酸化,則需要加入磷酸酶抑制劑 (ex: 100X Phosphatase Inhibitor Cocktail (A+B) (ACE Biolabs, A1029))。混合好的裂解細胞液可以直接繼續下一步處理,或是在4oC 下搖晃1-2小時,可以增加細胞裂解的效果,再透過離心去掉細胞殘餘 (12,000 g 10 mins),存放於-20 oC 或-80 oC。

如果此蛋白質樣本的目的是為了接下去的電泳,則強烈建議立刻接下去蛋白質處理來避免降解,只保留一小部分 (50 uL 以內即可) 測定蛋白質濃度。蛋白質濃度可以使用 Braford assay 或是 BCA assay (Dual-Range™ BCA Protein Assay Kit (BC03-500)/Dual-Range™ Bradford Protein Assay Kit (BR05-500))。需注意的是,裂解液中的兩性清潔劑和鹽類都會嚴重地干擾測定結果,所以蛋白質樣本必須先進行稀釋後才能測定 (至少稀釋十倍)。

 

  • 蛋白質前處理

開始電泳前,蛋白質必須先以 protein sample dye 處理。其目的有四,一是變性蛋白質,因為唯有變性後蛋白質的大小才和分子量呈正比,一般蛋白質在溶液中呈現球形,而 SDS 可以和蛋白質的疏水性區域作用,再因為負電端相互排斥將蛋白質拉呈線型。二是 B-ME 或 DTT 可以打斷蛋白質的雙硫鍵,使某些多聚體的蛋白質變回單體,也可以防止蛋白質本身氧化。前兩者同時還可以永久地抑制蛋白酶,所以建議盡量盡快處理。三是甘油 (glycerol) 可以增加溶液的密度,使得蛋白質樣本上樣時沉降到樣本槽的底部。最後是溴酚藍 (bromophenol blue) 染色,使得電泳時能有一個簡單的依據判斷進度。依據個人習慣可以選擇 B-ME 或 DTT,以及不同倍數的原液,ACE Biolabs 提供 5X Protein Sample Dye (ß-Me) (A1020), 5X Protein Sample Dye (DTT) (A1021), 6X Protein Sample Dye (ß-Me) (A1022), 6X Protein Sample Dye (DTT) (A1023)。以100 oC 處理10分鐘,置於室溫冷卻後,儲存於-20 oC。建議可以再次離心 (12,000 g 10分鐘) 去掉雜質,因為電泳時蛋白樣本中的雜質容易造成條帶不平整。

 

  • SDS-PAGE (含膠體配置、蛋白質樣本上樣、電泳)

開始電泳前需要先配置膠體,通常分成上膠和下膠,上膠稱為聚集膠體 (stacking gel),功能在於使具有一定體積的蛋白質樣本溶液壓縮到極小的體積。原理是因為電泳緩衝液中的 glycine 在上膠 pH 6.8 下不帶電,形成一電中性空洞區,使得蛋白質泳動非常緩慢,全部蛋白質樣本被濃縮到一條線,一直到進入下層膠體 pH 8.8,glycine 才會帶負電,蛋白質才會開始快速移動。而下膠稱為分離膠體 (separating gel),開始快速移動的蛋白質會因為不同大小而逐漸分離開來,由 acrylamide 形成的孔洞限制,小蛋白質移動地較快,大蛋白質則較慢。因此 acrylamide 濃度由目標蛋白質大小所決定,一般使用10%,如果目標蛋白質在50KDa 以下或是150KDa 以上才需要改變濃度,大分子量蛋白使用低濃度,而小分子量蛋白使用高濃度。

膠體中需要的成分可由 ACE Biolabs 中購買,包含 30% Acrylamide Solution (29:1) (C1005)10% SDS solution (A1024)ammonium persulfate (APS) (C3009)TEMED solution (C1012)。Acrylamide 形成膠體的基本骨幹,由 Bis 形成架橋,TEMED 當作催化劑,APS 提供自由基引發連鎖反應。配置過程中要確保所有溶液均勻混合,配方可以參考 (C1005),最後才加入 APS,並且要立刻製作膠體。下膠大約到整體的2/3,以甲醇或異丙醇壓平表面並且去除氣泡,等待約40-50分鐘凝固。去除甲醇或異丙醇後才倒入上膠溶液,快速插入齒梳後,等待約10-20分鐘凝固。

小心拔掉齒梳後 (切記不要破壞樣本槽),架設好電泳裝置,倒入適量的電泳緩衝液。加入處理後的蛋白質樣本,通常會加入相同量的蛋白質,記得要保留空格放入 protein marker。電泳步驟依據個人習慣使用,通常會用較低電壓進行聚集 (60-90 V 20-40分鐘),再用較高電壓分離不同大小蛋白質 (100-140 V 60-120分鐘)。電泳緩衝液的配方可在網路上查到,而 ACE Biolabs 提供特別的電泳緩衝液 10X FASTRunning Buffer (A1007),可以直接使用 170 V 60-70分鐘即可完成電泳全部過程,相比於一般的電泳緩衝液而言,可以在節省時間的情況下,保留完好的解析度以及避免溫度劇烈升高。

除了繼續進行轉印和使用抗體偵測目標蛋白質之外,有些實驗會需要檢測整體蛋白質的分布情形,比如蛋白質純化。這時就必須對膠體的所有蛋白質進行染色,傳統上使用 coomassie Brilliant R-250 (CBR) 染色 (染成藍色),半小時之內完成,但是最大缺點在於背景值非常高,需要以清水退染一整天,或是以具有腐蝕性和酸性的脫色液 (含甲醇和乙酸) 處理。而 ACE Biolabs 提供的 QuickBlue Protein Gel Staining (C6003) 可在相同時間內完成染色,而且背景值極低,只要使用清水即可在半小時之內完成退染。

 

  • 轉印 (transfer)

以電泳分離不同大小的蛋白質後,需要以專一性的抗體偵測,但是因為膠體本身脆弱不易操作,所以通常會將蛋白質轉印到膜上,最常見的是 PVDF (polyvinylidene-Fluoride) 和 NC (nitrocellulose)。NC 膜透過疏水性作用力吸附蛋白質,吸附力較強,價格比較便宜,但是本身質地比較脆弱,容易在反覆的清洗和反應中破損。而 PVDF 膜質地比較堅韌,可以反覆使用,但是價格比較昂貴,須注意的是其需要先以甲醇活化表面正電基團,才能夠有效地吸附蛋白質。

而轉印原理是透過電壓使得蛋白質移動到轉印膜上,在裝置時須注意蛋白質是從負極往正極移動,所以轉印膜必須靠近正極。過程有分成濕式 (wet) 和半乾式 (semi-dry),濕式轉印顧名思義就是需要比較多的緩衝溶液 (1L 以上),裝置好的卡夾 (包含濾紙、膠體和轉印膜) 整個浸泡在裝有電極的緩衝液裡。優點是因為緩衝溶液較多,所以比較不容易發熱,甚至可以整個拿到冷房裡進行,本身結果較為穩定,也比較適合大分子蛋白 (超過180 KDa)。缺點在於使用較多的溶液,而且耗費時間長 (兩小時以上)。而半乾式轉印的最大好處就是節省時間,通常半小時之內可以完成,原理是透過大尺寸電極板給予強大的電場,在兩電極之間放上膠體和轉印膜,所以也比較節省緩衝溶液 (100-200 mL,浸泡濾紙即可)。缺點在於不適合大分子量蛋白質,時間拉長會導致少量的緩衝溶液溫度遽烈升高,容易出現濾紙和膠塊被烤乾的情況。電壓電流都需要參考機器本身的使用方式,而緩衝溶液可以選用 Western Blot Transfer Buffer (Visual Protein, WTB500)。

 

  • 封閉 (blocking)

轉印膜和抗體反應之前,必須先進行封閉。轉印膜上除了蛋白質之外還有很多的空白區域,抗體本身也是蛋白質,很容易就吸附到上面,造成背景值增加,所以必須先封閉這些空白區域。實驗室傳統上也是最常見的方法就是3-5% non-fat milk (配在 TBST 或 PBST 裡),透過牛奶中的蛋白質封閉空白部分,通常反應時間為室溫一小時。雖然價格便宜方便,不過缺點在於通常接下去的抗體時間需要過夜反應,而且牛奶裡面本身蛋白質雜質較多,容易吸附在轉印到膜上的蛋白質上,使得訊號降低,有時也會因為牛奶中的蛋白質剛好能被目標抗體辨認,造成背景值增加。Visual protein 提供的 BlockPRO Protein-Free Blocking Buffer (20X) (BF20-50) 使用了奈米粒子封閉,可以有效地增加訊號,並且不容易和抗體反應。ACE Biolabs 提供的 Western Blot Signal Enhancer – Nanograde (A1001) 則進一步優化過程,可以直接將轉印膜浸泡在含有抗體的溶液裡,抗體反應的同時進行封閉,只需要1-2小時,可以使得 Western-blotting 在一天之內完成。須特別注意,封閉的時候需要緩慢地搖晃,使得整張轉印膜反應均勻。

 

  • 一級抗體反應 (primary antibody incubation)

封閉完的轉印膜開始和抗體反應。Western-blotting 的精髓在於透過抗體和目標蛋白質的結合,可以專一性地偵測目標蛋白質的含量。抗體依據使用時機可以分成一級和二級抗體,前者直接偵測目標蛋白質,後者則是偵測一級抗體,通常是辨認一抗的物種性 (如老鼠或兔子)。這樣進行的好處有二,一是可以有效地放大訊號,因為一個一級抗體可以同時被多個二級抗體辨認。二是由於抗體上必須帶有螢光或酵素,本身發出訊號,或是反應基質產生訊號,才能夠被偵測到。而在抗體上接上東西的步驟必須由試管內化學反應完成,無法由生物本身完成。所以如果只有一級抗體,則每支抗體都必須另外鍵結反應,而一支二級抗體可以針對所有同樣宿主產生的一級抗體,因此二級抗體可以大幅度地降低成本。

一級抗體有分成單株和多株,多株抗體可以同時偵測多的抗原,可以得到較強的訊號,不過也會有比較多的非專一性訊號,而單株本身專一性較高,但是訊號較弱。一級抗體通常配在封閉溶液裡,使用濃度介於1/500-1/5000,通常一支新的抗體必須要試驗最佳的濃度,有些甚至可以重複使用。而抗體的反應時間可在室溫1-2小時,或是4度過夜,根據經驗通常後者可以大幅度地降低反應抗體濃度。須特別注意反應時要緩慢地搖晃,使得整張轉印膜反應均勻。

 

  • 二級抗體反應 (secondary antibody incubation)

一級抗體反應完成後,需要先以洗滌液清洗三次,可以使用 TBST 或是 PBST,一次5-10分鐘。接下來才加入二級抗體,通常使用 TBST 或 PBST 配置,濃度1/10000-1/20000,室溫反應一小時。二級抗體上最常見的酵素為 HRP (horseradish peroxidase),為過氧化氫酶,具有高穩定性的優點。可參考 ACE Biolabs 的 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP (A1013S)Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP (A32211PI),網站上也可找到針對其他宿主的二級抗體。

 

  • 上機紀錄結果

加入基質以前也一樣需要洗滌三次,通常也會使用 TBST/PBST,不過有些經驗指出這兩種洗滌液中的鹽類和 Tween 會干擾基質反應,所以也可以使用 ddH2O 洗滌。基質依據反應結果可分成兩種,放出冷光或是直接呈色。3,3'-diaminobenzidine (DAB) 可以在反應完後直接呈現棕色,肉眼可見,且能長久保存,但是只能得到一張照片結果,而且要精確地捉準結束反應的時機。而冷光可由底片曝光或是由機器接收訊號,機器的好處在於可以即時地偵測,得到多張照片結果,再選擇適合的時間,避免固定的時間內某些訊號過弱或過強,可以參考使用 LumiFlash Ultima Chemiluminescent Substrate, HRP System (Visual protein, LF08-100)。

 

  • 轉印膜抗體剝離再生 (stripping)

如果蛋白質樣本非常珍貴,或者是不想再次進行電泳節省時間,則可以去除轉印膜上的一級和二級抗體,重新使用。Stripping buffer 原理是透過強酸和高鹽破壞抗體和抗原之間的交互作用,甚至是加熱增加效果,而 ACE Biolabs 提供FASTStripping Buffer – Mild (A1005)FASTStripping Buffer – Harsh (A1011),不需要加熱即可有效地去除抗體。需要特別注意的是,Stripping 時間控制在5-10分鐘以內,過長時間會導致轉印膜上的蛋白質脫落過多,造成之後偵測訊號低弱,而且需要重新封閉才能繼續和抗體反應。另外,Stripping 會導致些微蛋白質脫落,所以不能和沒有 stripping 的轉印膜一起比較。

 

最近瀏覽產品

    搜尋 客製化服務 產品 聯絡我們
    0
    線上客服 在线对话