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西方點墨法常見問題 ( Western Blot ) 2018/05/11

西方點墨法 (Western Blot) 為實驗室中最常使用於分析蛋白質的實驗,利用抗體與蛋白質專一性的特質,來偵測特定蛋白質的表現情況。

Western Blot 從蛋白萃取、蛋白定量、蛋白質電泳、轉漬、Blocking、抗體選用到最終ECL的選擇,每個步驟環節繁瑣,因此影響實驗結果的變因也相對的多。

ACE Biolabs以自身代工服務多年的經驗,整理出Western Blot常見的問題以及處理方式,幫助客戶解決實驗上的困擾,並且也提供Western Blot代工服務,幫您呈現完美的實驗結果。

 

Q1. Protein Band 不一致

1. 凝膠不均勻 : 增加凝膠時間,或是確認APS是否fresh,APS會影響凝膠速率。(ACE Biolabs C3009)

2. 樣品中鹽類濃度不一 : 將樣品純化去鹽,加入相同的buffer。

3. 上樣體積不一致 : 加樣前,使用RIPA or ddH2O 將樣品體積配置成相同。

4. 電泳時溫度過高 : 降低電流或是電壓,

 

Q2. 目標蛋白訊號弱

1. 樣品input不足 or 目標蛋白表現低 : 加大樣品Input,濃縮樣品蛋白。

2. 轉漬效率低 : 依目標蛋白大小,選擇適合的轉漬電流、時間。

3. 抗體效率不佳 : 增加抗體濃度或增加培育時間。

4. ECL失效 : 注意A、B劑不可混用,造成失效。

5. ECL作用時間不足 : 延長ECL時間作用,或是蛋白訊號較微弱,改選擇靈敏度更高的ECL。(Visual Protien LF08-500Visual Protein LF16-500)

6. 曝光時間不足 : 延長曝光時間。

 

Q3. 轉漬效率低

1. 轉漬過程中溫度過高 : 將transfer buffer預冷,或將transfer tank置於4度環境中。

2. 轉漬條件未抓好 : 依目標蛋白大小,選擇適合的轉漬電流、時間。

3. Transfer buffer pH值與目標蛋白等電點相近 : 提高Transfer buffer pH值。

 

Q4. 背景過高

1. Blocking使用量不夠 : 提高blocking buffer濃度,增加blocking時間。

2. Blocking buffer選擇不當 : 偵測磷酸化蛋白,需選用Protein-Free Blocking buffer (Visaul Protein BF01-1L)

3. Blocking時間不夠 : 建議室溫一個小時以上,或是4°C  overnight。.

4. 抗體非專一性結合 : 降低抗體濃度、減少培育時間。

5. 抗體濃度過高、Wash不夠 : 降低抗體濃度、增加Wash時間與次數。

6. HRP substrate過多 : 減少HRP substrate用量,或是依蛋白量,選擇適合靈敏度的ECL。(Visual Protien LF08-500Visual Protein LF16-500)

 

Q5. Multiple Band

1. 樣品組成複雜 : 先進行樣品前處理。

2. 抗體專一性不足 : 應選擇高專一性、高靈敏度、批次間一致性高的抗體。

3. 二抗與抗原有交互反應 : 選擇適合的Blocking buffer。

5. HRP Substrate反應過久、曝光時間太長 : 縮短反應時間、曝光時間。

 

Q6. 曝光後無訊號

1. Gel與Membrane方向相反 : 轉漬時,務必確認,Gel靠近負極(-)Membrane靠近正極(+)

2. 蛋白含量是否低於檢測極限 : 使用Postive control確認抗體以及試劑皆有作用,如待測樣品依然無訊號,加大樣品Input,濃縮樣品蛋白。

3. 抗體效價過低 : 增加抗體濃度。

4. 抗體培育時間過短 : 增加培育時間,37°C 1小時以上。

5. 抗體過度Wash : 減少Wash時間與次數。

6. 加入HRP substrate與曝光檢測時間間隔過久 : 應加入HRP substrate 3-5鐘內即時壓片或是使用冷光系統進行拍照。

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