Western blotting | 如何解決背景過高的問題

Western blotting | 背景過高問題

在進行Western blotting時常有背景過高的問題，那為什麼會出現背景過高的狀況呢？背景與呈色有關，因此，影響呈色的的因素即會影響背景。

以下介紹影響呈色原因：

［Blocking］

由於轉印膜上除了樣品蛋白質，還有許多空白區域，因此需先封閉這些空白區域，防止抗體非特異性地結合到轉印膜上，造成背景增加。因此，可以藉由調整Blocking buffer的配方與使用時間，減少背景過高的問題。

(1) 選用不同的blocking buffer:

常用的blocking buffer有牛奶、Bovine serum albumin (BSA) (ACE Biolabs, C3001)、Protein-Free blocking buffer (ACE Biolabs, A1010)，然而牛奶中成分較複雜且含磷酸化蛋白質，可能造成訊號干擾及背景較高，因此您可以嘗試不同的blocking buffer。

(2) blocking不完全:

可以嘗試延長時間，也可以於4度blocking過夜。使用BSA的情況下也可以增加濃度至5-10%。

［一級抗體］

透過抗體和目標蛋白質的結合，專一性地偵測目標蛋白質含量。當抗體稀釋濃度太高可能導致雜訊產生、背景值過高也浪費昂貴的抗體；稀釋濃度太低又可能導致訊號無法被偵測或不明顯。因此，可以藉由調整一級抗體濃度及時間減少背景問題。

(1) 調整一級抗體濃度:

拿到抗體時，先進行抗體濃度梯度測試實驗，選用適當濃度進行實驗

(2) 增加一級抗體培養時間:

將一級抗體使用Blocking buffer稀釋，於4度培養過夜，增加專一性。

［洗滌步驟］

洗滌不充分會造成抗體在轉印膜上非特異結合，導致高背景問題發生。

因此可以藉由增加洗滌次數和用量，或在洗滌液中添加Tween-20、SDS或NP-40等表面活性劑，去除未結合的抗體、減少非特異性結合。ACE Biolabs提供 ACEolute™ TBST Instant Granules, pH8.0, 1L/pk，Tween 20 終濃度為0.05%。

［ECL呈色］

當目標蛋白質訊號較強時，只需要短時間曝光即可偵測到訊號；然而當目標蛋白量較少時，則需藉由增加曝光時間與ECL靈敏度得到實驗結果，增加曝光時間的同時，也需考量ECL的持久度。ACE Biolabs提供三款ECL冷光試劑，ACEsignal Chemiluminescent Substrate–EcoPlus (ACE Biolabs, A1040) ACEsignal Chemiluminescent Substrate–Pico (ACE Biolabs, A1041) ACEsignal Chemiluminescent Substrate–Femto (ACE Biolabs, A1042)，您可以根據預算與實驗設計，選用最適合的ECL已得到最佳實驗結果。

［ACE Biolabs 抗體優化服務］

每支抗體，每種樣品都有最適合的 Western Blotting 的條件，需憑藉著深厚的經驗累積，從WB結果回推過程，一步一步調整，才能呈現完美的 Western Blotting 結果。您可以參考ACE Biolabs 所整理的西方點墨法常見問題 ( Western Blot )，快速累積經驗，或是交由ACE Biolabs 幫您找出最適合的 Western Blotting 的條件。

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